光声光谱技术在光合作用研究中的应用

光声光谱技术在光合作用研究中的应用
1当光照射密闭容器里的样品时，容器内能产生声 波，这一现象称为光声效应。光声光谱是基于光声效 应的一种光谱技术。早在1880年Bell就发现了光声 效应，但直到20世纪70年代，Robin和Rosencwaig 的研究工作n 表明光声光谱法可以用来测定传统光 谱法难以测定的光散射强或不透明样品时，光声光谱 才开始引起人们的广泛重视。近年来，随着新光源、 学和生物技术研究特别支持项目共同资助。 声传感技术以及微弱信号检测技术不断进步，加上光 声光谱学理论逐步完善，光声光谱技术得到迅速发 展。目前，光声光谱技术已广泛应用于物理学、化学、 生物学、医学和环境保护等众多领域。 20世纪70年代中期以来，研究者开始应用光声 光谱技术研究光合作用。Adams等 得到完好和捣 碎了的菠菜叶子的光声光谱图，与所提取的叶绿素的 吸收光谱完全一致；Malkin等[3 首先应用光声光谱 技术来检测光合作用的能量利用效率；Buhs等 发 现在气态光声池装置下出现的强烈信号来自光合作 用放氧；Poulet’~：2提供了分析光声矢量信号的数学分 析方法，针对实验中出现的气体吸收信号以及为区分 光声放氧信号和气体吸收信号；Reising等 组建了 气态脉冲式光声仪。总之在不到30a时间，光声技术 被越来越广泛地运用到光合作用研究领域。

l 光合作用研究中光声光谱技术的特点 光声光谱技术目前已普遍应用于光合作用的研 究，相比于其它技术．
光声光谱技术具有独特的特点。 (1)光声光谱技术是目前光合作用放氧测定技术中时 间分辨率最好的一项技术。这是因为普通氧电极是通 过电化学的方式，而光声光谱技术通过物理的光声效 应来检测放氧信号。(2)利用光声技术可以方便地研 究叶片的状态转换和环式电子传递生理功能，而过去 对状态转换和环式电子传递的研究主要利用叶绿体。 (3)利用光声技术可以监测到光合作用中快速C()! 吸收情况，而这一点用常规的气体交换技术是很难实 现的。(4)利用光声技术还可以了解光合反应中心在 照光后因为分子结构重排而导致的体积变化，从而研 究这种体积变化对瞬态光谱吸收数据造成的影响。 (5)利用光声光谱结合叶绿素荧光技术可以很好地研 究自然状态下叶片的抗逆生理机制L7]。(6)利用光声 光谱技术可以直接测量光热效应，也即所吸收的光能 有多少转化为非辐射的热耗散，而目前常用的叶绿素 荧光技术只能间接估计热耗散所占的份额。(7)光声 光谱技术还能测定光合过程中的能量转化效率等等。 光声光谱技术特点的体现是与不断发展的光声 光谱理论和不断改进的光声光谱设备紧密相关的。

2 光合作用研究中光声信号分析 光声信号可以为气态环境中的微音器和液态环 境中的压电传感器所检测到。 用于光合作用研究的光声光谱仪有四种类型．即 气态调制型光声光谱仪、气态脉冲型光声光谱仪、液 态脉冲型光声光谱仪．以及目前已经出现液态调制型 光声光谱仪 。 对气态光声光谱仪而言，如果光合样品是叶片， 气体交换信号和样品周围气体的热涨缩是产生的光 声信号的主要组分。两种组分的物理学性质不一样， 热组分从叶绿体逸散到周围空气中的速度比气体交 换组分要快。 对于气态脉冲式光声仪而言，由于上面所说的物 理学性质上的差异，第一个光脉冲所产生的光声信号 是光声热信号，其后均为气体交换信号，这样就可以 区分这两种组分 。 ；对于气态调制型光声光谱仪，当 加上饱和背景光时，光合系统处在饱和状态，光合气 体交换速率不变，而光热组分随调制光变化，利用锁 相放大器将光热信号检测出来，这样可以区分这两种 组分。；如果将调制频率提高到100Hz以上。这时放 氧信号跟不上调制频率的变化，锁相放大器只能将光 热信号检测出来，采用这种方法也可以区分这两种组 分；此外，可以利用特殊的传感器来区分这两种组分， 如LiNbO。压电传感器晶体与气体之间的声学阻抗 不匹配，因此，只能检测到光热信号l】 。 。 如果光合样品是叶绿体悬浮液等液态制品(包括 PSⅡ和PS l的光合反应中一12,)，气态光声光谱仪只能 检测到热涨效应，这是因为在液体中，氧的逸散途径 变长以及液体表面的存在，大大衰减了放氧信号并导 致调制放氧频率变小，因而锁相放大器不能检测 到 。液态光声光谱仪不仅可以检测到热涨效应。而 且可以检测到反应中心的体积变化 ，热涨效应与样 品温度相关而反应中心的体积变化与光照强度相关。 由于光合样品吸收一部分光能进行光合作用，将 能量储存于光合作用的中间和最终产物，这种作用与 光合样品的光声热涨效应相竞争，降低了光声热信 号，降低部分的相对值即为能量储存或称光化学损 失。对叶片能量储存的测定一般将调制频率调高到 100Hz以上，或采用水渗叶的方式 。 气态光声技术还能检测光声放氧信号的相对大 小．称为氧的相对量子产率。

3 光合作用研究中光声技术的发展 影响光声效应的因子很多，如样品的物理结构、 传导性质及叶圆片的气体交换等，因此，光声技术和 装置是多种多样的。
3．1 气态光声检测 通常所用的光声技术是将样品置人含有微小体 积气体的光声池中，检测光声效应所引起的气体压强 的变化．Ducharme等 首先设计了这种光声装置用 于光合作用。这种装置很适合于活体叶(离体的或非 离体的)的光声测量，可以方便地测定放氧的相对量 子产率、能量储存等。
气态光声光谱仪一般由电源、光源、光声池、传 感器、放大电路和输出设备构成。传感器一般采用微 音器；放大电路有两种选择，对于调制型光声光谱仪， 放大部分采用锁相放大器只对同频率的信号进行放 大，这样可以提高仪器的信噪比并排除其它非调制信 号的干扰 ，对于脉冲型光声光谱仪。利用精密的放 大电路直接将信号放大。研究者对气态光声光谱仪进 行了各种改进以用于不同的研究目的，比如为研究植 物叶片不同层次细胞的光能利用情况，Han等 巧 妙地改进这种气态调制式的光声仪，使之可以测定叶 片不同层次的细胞的放氧相对量子效率。
气态的光声装置有以下的局限性：(1)因为光声 池体积微小(

3．2 液态光声检测 利用压电传感器可以对渗水叶、叶绿体悬浮液等 液态制品因照射光而产生的光声信号进行检测。此时 光声池不必密封，气态光声检测技术所出现的局限性 都可以避免，并且可以将时间分辨率提高到1 ms以 内_ 。Brumfeld等 改进的液态调制式光声技术将 调制频率提高到10 kHz(也即每周期100 s)，十分 有利于研究光合反应中心从微秒级到毫秒级的反应。 此外，液态脉冲式光声仪的时间分辨率已经达到50 ps 。 液态光声检测的局限性在于不能检测光合气体 交换信号，只能检测光声光热信号和体积信号的变 化。温度计| 温度表| 风速计| 照度计| 噪音计| 辐照计| 声级计| 温湿度计| 红外线测温仪| 温湿度仪| 红外线温度计| 露点仪| 亮度计| 温度记录仪| 温湿度记录仪| 光功率计| 粒子计数器| 粉尘计|

3．3 光声技术与叶绿素荧光技术的结合 普遍认为光声放氧信号、光声热信号与叶绿素荧 光有密切的关系。为研究这种关系，Snel等 声与荧光结合的仪器，光声池的下表面同时置上检测 光声信号的声敏传感器和检测荧光的PAM101仪的 光纤。Kolbowski等 将脉冲式气态光声与PAM101 荧光仪结合起来，初步显示了荧光、光声放氧、光声 能量储存和光声气体吸收信号的同时测量。

 4 光声光谱技术在光合作用中的应用
4．1 光谱扫描 如果单独考虑光声光热效应，则光声光谱技术可 以用来进行非破坏性的植物色素吸收光谱的扫描。改 变调制频率和位相可以进行不同深度色素扫描分 析 一。此外，不同深度的能量储存扫描结合光纤 微探测器可以用来研究不同层次叶肉组织的光能利 用梯度 。但这种光谱扫描的方法具有一定的局限 性，即光声能量储存信号叠加在光声热信号上，会对 色素吸收光谱造成影响 。
4．2 光声能量储存的性质 Carpentier等 ” 采用气态调制型光声技术研 究了光系统I(PS I)和光系统Ⅱ(PSⅡ)的能量储 存性质，能量储存能量储存的倒数与入射光强I呈线 性关系，DCMU处理大大降低PSⅡ的能量储存的光 饱和曲线中的半光强i50；电子受体铁氰化盐(Fe (CN) 。)也降低了PS Ⅱ 的i50； 二氯靛酚蓝 (DCIP)／四甲基对苯二胺(TMPD)增大了DCMU 处 理的PSⅡ的i50值，这些结果说明，PSⅡ的能量储存 值反映在调制周期时间内光照导致的PSⅡ还原侧质 体醌库(PQ库)的还原状态。电子供体、电子受体 对PS I反应中心能量储存的影响结果说明，PS I的 能量储存也反应在调制周期时间内PS I还原侧FeS 中心的还原状态。’?。
4．3 环式电子传递 以PS I为中心的环式电子传递在生理上的功能 和意义一直不太清楚，其中原因之一是很难直接测量 自然状态下环式电子传递。近年来通过光声技术对 PS I的能量储存的研究，给出了环式电子传递存在 的有力证据。Veeranjaneyulu等 ⋯研究光声放氧信号 和能量储存信号的波长谱，放氧到710 nm处降到0， 而能量储存在700～ 720 nm 处还仍然存在； Carpentier等 用DCMU 处理绿藻后发现还存在一 小部分的能量储存；Canaani等 ¨利用光声技术发现 在光抑制的情况下Ps l储存一定的能量；Canaani 等 对绿藻(Dunaliella salina)进行盐胁迫处理 (4M)，与对照相比，710 nm的能量储存上升、而解 耦联剂nigericin抑制这种能量储存的上升趋势；而 DCMU所抑制不了的能量储存可以用2，5-dibromo一 3 methyl 6-isoprophyl—P benzoquinone(DBMIB)完全 抑制，这些结果都说明存在以PS I为中心的环式电 子传递，而且这种电子传递对植物抗逆性起了十分重 要的作用。 研究者利用光声技术对环式电子传递储能的大 小和PS I参与环式电子传递的程度以及环式电子流 的大小和类型进行讨论 “ 。Jacque 胡利用电子受 体和抑制剂研究一种藻()hlamydomonas reinhardtii， 以PS I为中心的环式电子传递的类型：一种环式电 子传递对DBMIB／MV(甲基紫精)敏感，说明PQ和 铁氧还蛋白参与其间；一种对抗酶菌素A(ANT)、粘 噻唑菌醇和2 n—heptyl 4一hydroxyquinoline N oxide (HQNO)敏感，说明细胞色素b6(Cytb6)参与其间； 一种为NADPH 所调节。
4．4 状态转变与爱默生效应 在光合系统中，两光系统的能量分配可以发生变 化，称为状态转变；爱默生增强效应直接反映在状态 I下能量分配有利于PSⅡ这一现象。利用光声技术 可以方便地研究状态转换以及爱默生增强效应。 对于在状态I下能量分配有利于PSⅡ，而在状 态Ⅱ下两个光系统的能量分配趋于平衡的机制目前 仍解释得不清楚，有研究者认为激能满溢造成了能量 从光系统Ⅱ向光系统l的倾斜。激能满溢假说有许多 争议，另一种可能原因是捕光色素蛋白复合物Ⅱ (I CH Ⅱ)的磷酸化并向基粒非垛叠区的PS I移 动 ’ ，增大了PS I的吸收光的截面积。 Canaani等 利用光声技术和荧光技术研究一 种藻Nostoe在710nm 光下的爱默生效应，结果说明 在从状态I转变到状态Ⅱ时，有15 ～21％ 的能量 从PSⅡ转移到PS I。在这种状态转变中捕光色素蛋 白复合物I (I HC I)／Ⅱ被磷酸化并发生可逆移 动一“ ，这种转移导致PS I／PSⅡ吸收截面积的显著 变化～ ，用磷酸化酶的抑制剂NaF可以抑制状态改 变的发生 。 然而用I CH Ⅱ的磷酸化并不能完全解释状态转 变发生的机理。Canaani等一 发现缺失叶绿素的突变 苗的状态转变产生的原因是激能满溢，而正常植株却 是PS I／ps I吸收截面积改变造成状态转变。 Mullineaux等一 。用液态脉冲式光声仪测量一种藻 ((Tyanobacte, ia1)的细胞在状态转变过程中630 nm 处光热变化过程，发现在状态I和状态Ⅱ下光热组分 均为2O 左右，说明在状态Ⅱ下，藻胆蛋白体细胞的 捕光复合物并没有离开PSⅡ 。
4．5 应用液态脉冲式光声仪研究光反应中心的原初 光化学过程 通常用超快速吸收光谱研究反应中心的电子传 64 递过程，但是照光后的反应中心由于分子重排导致结 构发生变化，这种结构变化可能对光谱造成影响l_4 。 近年来研究者应用液态脉冲式光声技术对反应中心 在纳秒级到微秒级内光诱导的结构变化进行研究。液 态脉冲光声信号由热信号和结构变化引起的体积变 化信号所组成，区分这两种信号可以采用降低温度的 方法，在4(、左右热变化信号消失，只存在体积变化 信号。出现的光声负信号被认为是分子重排导致的结 构变化引起的， 出现的时间在5O ns以内 j， 对于 Phodobacter sp—R一26光合细菌，这种结构变化发生在 Behl P Q 和BchlP Q 一之间。这种结构变化导致 的体积变化大致在10×10 。m／mll3 、20×10 。m／ ml～ 和32×10 。m／ml 之间，由于时间分辨率目前 还到不10ps， 还需要进一步研究。
4。6 光声瞬态研究 用气态调制光声技术检测的暗适应叶受光照后 出现一个短周期的光声信号(产生时间小于1 s)，文 献 上称为Oxygen Gush。同时或随后出现一系列的 复杂的瞬态，包括光热信号(能量储存信号)，氧气 释放信号，气体吸收信号，最后趋向于稳态H ’ 。 这种复杂的光声动态变化曲线和光照强度，暗适应时 间、温度、气体成分等环境因子相关。 暗适应叶在重新照光时，叶绿素荧光迅速上升的 同时光声信号的放氧组分下降l_4 ’”]。Malkin E44 3对暗 适应11 min的叶照70Wm。!强调制光时，观察到氧 峰的下降沿与荧光的上升沿明显相关。可能说明水到 PQ库电子传递受限从而导致荧光上升而放氧下降。 一般而言，会出现第2个峰。在高浓度CO 下出现负 信号，该负信号被认为代表与光反应过程结合紧密的 气体吸收。HavauxL4。 认为第1个氧气释放峰与叶绿 素荧光的0 P段线性相关，其他的并没有显著的线 形关系。Bukhov等 对成熟叶测光声变化和可变荧 光淬灭组分Afast／Aslow之间的关系发现光照初期 20 S内，Afast／Aslow没有变化而氧峰出现下降，光 化学淬灭不变；20 S过后，Afast／Aslow与光声信号 的线性相关程度逐渐变大。光化学淬灭变大。这说明 在光照初期20 s内，光系统Ⅱ的初级电子受体(Q ) 全部还原而电子传递到PS I的能力低。在20 s之后， 光合活性增强，Afast／Aslow变大说明线性电子传递 变强。可能第1个氧峰反映的是诱导初期PSⅡ的电 子传递的瓶颈现象 。 由于高频下光声的信噪比变小，因而较难准确地 观察到能量储存的瞬态变似“]。Snel等 。。以370 Hz 的调制光测定光化学能量损失光化学损失，发现在强 饱和背景光(30Win～。)下存在双相变化，快过程反 映光合最小热耗散(小于10 ms，此时光合机构处在 最有效状态)；慢过程1 S内完成，在这个时间段非光 化学淬灭并未形成，因而说明光合系统的电子传递受 限。在前30 S内，放氧与光化学损失不成比例，可能 是某种电子传递并未伴随着能量储存的产生。 Malkin等 E 用水渗叶在低频下观察能量储存的瞬态 变化，一开始出现最大光热信号(即能量储存最小)． 随后趋于稳态。然而这种瞬态并未小到可以忽视的程 度，因此，他认为这种能量储存瞬态可能反映PS I途 径的电子传递(内源电子供体或循环式电子传递)。30 min暗适应可使这种能量储存瞬态达到最小。低光强 的能量储存瞬态接近于稳态而高光强的能量储存瞬 态值下降。说明甚至在光合诱导的初期，低光强下的 PSⅡ仍保持着有效的光化学电子传递。诱导期问光 声热信号也曾出现几个瞬态峰，与放氧和气体吸收峰 相对应。 在研究光声放氧动力学的过程中，有研究者发现 在某些情况下出现气体吸收信号 。]。光声气体吸收 信号是与光声氧气释放信号叠加在一起的，为区分这 两种信号，Kolbowski等l9 设计计算机控制的脉冲调 制系统分析光声信号．发现氧气释放峰在5 ms，而气 体吸收峰在7 ms。Reising等 利用这种结合荧光的 新型光声仪进一步研究光声气体吸收瞬态。发现气体 吸收和类囊体膜能量化有紧密的关系，非光化学淬灭 上升伴随着气体净释放的略微下降。高浓度的CO 诱导这种气体吸收的发生。在MV存在的情况下，低 浓度的氧气和高浓度的氧气环境中，气体吸收峰面积 不一致，说明这种气体吸收并不是(1，5一二磷酸核酮 糖羧化酶／加氧酶)催化的羧化或加氧反应。因此目 前认为这种气体吸收有两种可能：(1)因为光诱导的 基粒pH值升高 ¨随后高pH值诱导碳酸盐的形成 导致CO!的吸收 ；(2)各种类型的() 吸收 。日本万用MULTI| 日本三和SANWA| 日本横河YOKOGAWA| 日本日置HIOKI| 日本加野KANOMAX| 日本新宇宙COSMOS| 日本凯世KAISE| 日本新宝SHIMPO| 日本爱宕ATAGO 光声气体信号中出现气体吸收信号，但这种气体 吸收信号到底是() 吸收还是CO 吸收?如果不解决 这个问题，光声技术研究在检测光合作用气体信号上 就有很大的局限性。Reising等。。 应用光声脉冲调制 技术，加入碳酸酐酶的抑制剂ethoxyzolamide，部分 抑制了这种吸收信号，但不影响()。释放和荧光诱导 曲线，暗示这种吸收是CO 快速溶解所致(为碳酸酐 酶所催化)。Havaux等 在研究热胁迫时发现48(、3 min热胁迫导致气体吸收的产生。起初他认为这种气 体吸收是热胁迫导致的Mehler反应加速进行。在随 后的研究中，Havaux等 认为这种气体吸收是快速 的CO。快速溶解，热导致的这种气体吸收对DCMU 不敏感，对PC抑制剂HgC1 敏感，这些结果说明了 广西科学 2004年2月 第11卷第1期 热胁迫下气体吸收联系着PS I，而与PSⅡ无关。 Tabrize等 对CO 吸收曲线增加了一个修正系数， 解决了CO 吸收曲线随其浓度变化的影响，其实验 结果证明这种气体吸收与质子梯度的建立紧密相关。 Reising等 胡用烟草突变植株再次证明这种气体吸收 是CO 快速吸收。 如果这种气体吸收是CO：快速吸收的话，可以 用光声技术研究自然状态下碳酸酐酶在光合作用中 的功能，而在以前是很难做到这一点的 ；可以采用 Poulet等 的方法精确得到放氧的相对量子产率；此 外， 可以更好解释Canaani等h ]所谓的弱光适应 态。
4．7 环境胁迫
4．7．1 热胁迫与冷胁迫 Havaux等 ” 用光声技术测量两种蚕豆叶片在 热胁迫下的氧相对量子产率和能量储存，发现耐热品 种的氧相对量子产率和能量储存比不耐热品种保持 稳定的时间长，而能量储存又比放氧稳定。这说明PS I较PSⅡ对热胁迫不敏感。低光强可以保护蚕豆叶 片抵抗40(、的温和胁迫，而且热胁迫刺激了PS I的 能量储存，这说明与PS I相连的环式磷酸化活性增 强以产生ATP来修补被破坏的PSⅡ “ 。此外，48 C 胁迫下3 min光声信号出现的气体吸收被认为是 Mehler反应所产生的() 光还原 。Havaux等_6门研 究PS I对热胁迫的短期响应，发现PS I存在着独立 于PSⅡ的电子流途径，这说明在热胁迫条件下PS I 存在着一种自我保护机制。 Yakir等 结合叶绿素荧光和光声技术研究 冷胁迫对西红柿叶片的影响发现黑暗中冷胁迫对氧 释放量子产率、叶绿素荧光和二氧化碳的吸收均无明 显的影响，而一旦照光，三者均急剧下降。
4．7．2 光抑制 Buschman 在研究中发现萝卜子叶被强光(600 W ·m )抑制1 5 min内，能量储存大大减小，同时 伴随可变荧光的降低。Havaux 在329Hz频率下测 豌豆叶片的光热值，发现在强光(4000／xmol photons／ m!×S)下15 min内，光热值增长了两倍，而在685 nm处叶绿素荧光和放氧信号(14 Hz)都降低。这说 明非辐射的热耗散的升高是叶片对强光的一种保护 机制的反映，在强光胁迫下，光合系统把吸收的过多 能量以热的形式散发出去。Canaani等∽ 发现能量储 存要比氧气释放对光抑制不敏感，这也许是环式磷酸 化的作用。 光抑制下光声热信号升高的机理目前并不清楚， 一个观点认为光系统热耗散的升高伴随着类囊体pH 值梯度的建立和荧光发射的降低 。叶绿素荧光的 能量淬灭qE反映了质子梯度的建立，然而qE在暗 中数秒内即恢复，而光声热在暗中恢复很慢。 。 Havaux等 ” 用(DTT)二硫代苏糖醇处理受光抑制 的叶片，抑制了玉米黄素的形成，同样造成了光热值 的上升，说明热散失升高不是因为玉米黄素形成导 致。 4．7．3 水分胁迫 用光声技术和荧光技术结合起来的方法对水分 胁迫下的西红柿叶片的研究表明，PSⅡ的人工电子 供体可以减缓干旱对PSⅡ氧化侧的伤害，PS I相对 来说不受干旱影响，状态I到状态Ⅱ的改变受到抑 制，这使叶片处在状态I，光能量分配有利于PS Ⅱ一 。快速的水分胁迫主要影响PSⅡ的氧化侧，而 慢的水分消耗在前6 d主要影响能量储存，PS I保持 稳定，进一步的缺水将损害PS I，使双光增益大大降 低：。 。

5 结束语 应用光声光谱技术在研究光合作用的过程中出 现了许多新的现象需要解释，比如说光热信号与叶绿 素荧光的能量淬灭之间的关系；光声放氧信号中出现 的氧峰信号产生的机理；光声气体吸收信号到底是 o：吸收还是CO：的快速溶解；光声检测到的反应中 心在原初光化学反应过程中体积变化所发生的时间 和大小等等。这些现象有的已得到初步结论，有的还 在研究过程中，但无疑光声光谱技术在光合作用研究 中的应用大大开拓了视野，丰富了我们对光合作用机 理的认识。

 胁迫下的西红柿叶片的研究表明，PSⅡ的人工电子 供体可以减缓干旱对PSⅡ氧化侧的伤害，PS I相对 来说不受干旱影响，状态I到状态Ⅱ的改变受到抑 制，这使叶片处在状态I，光能量分配有利于PS Ⅱ一 。快速的水分胁迫主要影响PSⅡ的氧化侧，而 慢的水分消耗在前6 d主要影响能量储存，PS I保持 稳定，进一步的缺水将损害PS I，使双光增益大大降 低：。 。

5 结束语 应用光声光谱技术在研究光合作用的过程中出 现了许多新的现象需要解释，比如说光热信号与叶绿 素荧光的能量淬灭之间的关系；光声放氧信号中出现 的氧峰信号产生的机理；光声气体吸收信号到底是 o：吸收还是CO：的快速溶解；光声检测到的反应中 心在原初光化学反应过程中体积变化所发生的时间 和大小等等。这些现象有的已得到初步结论，有的还 在研究过程中，但无疑光声光谱技术在光合作用研究 中的应用大大开拓了视野，丰富了我们对光合作用机 理的认识。