荧光分光光度计法的一些研究

 

　　再制干酪是采用一部分天然干酪(50％左右)，加上一些提供蛋白质、脂肪的原料(脱脂乳粉、乳蛋白、奶油等)，再加上香料、色素、稳定剂、水，有时还添加防腐剂.然后在乳化盐、加热搅拌、脱气、冷却的作用下形成的一种干酪食品.经常用作切片或涂抹食用。

　　再制干酪是一种极受欢迎的食品，食用时要经历融化过程。融化性在一定程度上反映干酪加热后的流动和扩散情况。天然干酪的类型、乳化盐的种类及用量，冷却温度、冷却时间、剪切速率等都有会影响再制干酪的融化性。融化性是衡量再制干酪质量的一个重要指标。为了生产出满意的产品，生产者需要测定再制干酪的融化性。经验式测融化性的方法有：Arnott融化测试法、Schreiber融化测试法、融化管测试法。这几种方法中较为常用的是融化管测试法， 融化管测试法要控制干酪加热条件，受热后干酪产生流动性，测量干酪流动的距离， 即为干酪的融化性。经验式测融化性的方法有很高的可变性，它只反映干酪融化性的一种趋势。以流变学为基础测融化性的方法包括动态剪切流变仪法、改良式挤压流变仪法等。但这几种方法有破坏性，且费时、操作困难。因此迫切需要一种无破坏性、快速测定再制干酪融化性的方法。

　　荧光分光光度计法可在分子水平上反映再制干酪的融化特性.它是一种非破坏性的、快速测定再制干酪融化性的方法。由于再制干酪吸光率在0.1以上，产生反射作用(内部率片作用)减少了荧光强度，导致激发光谱的扭曲。为了避免这个问题。Parker发明了一种支架， 它将光的入射角由90°变为56°。从而减少光的散射。用这种支架的荧光分光光度计被称为前镜荧光分光光度计(见图1、图2)。它可以在分子水平上反映胶体的不同流变特性.并已经被成功的用于乳制品和软质干酪的测定中。它也可用来测定天然干酪的质地。S K Garimella研究发现它也可用于测再制干酪的融化性。

　　前镜荧光分光光度计在反映蛋白质分子相互作用上也有一定的优越性。前镜荧光分光光度计能提供蛋白质结构和相互作用的信息。第一，它比其它分光光度计灵敏100-1000倍。第二，荧光物质对环境极为敏感，蛋白质结构的改变，会导致色氨酸的含量和发射波长的改变。另外，荧光物质的荧光团对溶液粘性的改变极敏感。第三，荧光检测方法是非常快速的。

　　本实验的目的是用一种新的方法测定涂抹型再制干酪的融化性。实验选取6种市售涂抹型再制干酪为原料，分别用融化管法、荧光分光光度计法测定其融化性。通过比较， 本研究探讨了用前镜荧光分光光度计测定融化性的可行性。

1.1 实验材料

　　所用干酪均从超市购得.于冰柜4℃放置。6种用于实验的干酪分别为：奶油口味涂抹再制干酪(荷兰)、蘑菇口味涂抹再制干酪(荷兰)、优质涂抹再制干酪(德国)、草莓口味涂抹再制干酪(法国)、巧克力口味涂抹再制干酪(法国)、洋葱口味涂抹再制干酪(法国)。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 化学试剂

　　98％硫酸，40％ 氢氧化钠溶液。2％硼酸溶液，25％ 氨水(均为质量分数)；乙醚，石油醚，乙醇，混合指示剂(甲基红+溴甲酚绿)等。化学试剂均为分析纯。

1.2.2 主要仪器

　　日立F4500荧光分光光度计(日本)，自制支架，自制管式融化计，320酸度计(梅特勒公司)，JD500-2型电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)，凯式定氮仪(FOSS公司)，202型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.3 测试方法

1.3.1 成分测定

(1)水分测定

　　采用直接干燥法。每个样品重复测试2次。取平均值为测试结果。

(2)蛋白质测定

　　测定方法参见GB 5009.5-85。每个样品重复测试2次。取平均值为测试结果。

(3)脂肪测定

　　测定方法参见GB 5009.5-86。每个样品重复测试2次，取平均值为测试结果。

(4)pH测定

　　取12 g干酪样品加入40mL、30℃蒸馏水， 研钵至完全溶解， 常温下采用pH计测定。

1.3.2 融化管法测定融化性

(1)测试方法

　　取20g样品装入垂直放置的38mm×200mm的玻璃管中，样品堆积在管底形成一定的高度，玻璃管的一端用胶塞封住，另一端用中间打孔的胶塞封上，孔中水平插入玻璃细管，将融化管水平放入110℃ 的烘箱中，放置10min，测量干酪流淌的长度，作为融化性指标。每个样品重复测试4次。

1.3.3 荧光分光光度计法测定融化性

(1)原理

　　干酪中所有的蛋白质(包括酪蛋白)至少残留1种色氨酸，且色氨酸是一种天然的荧光物质，因此可以用色氨酸的发射光谱(305~400nm，激发光谱290nm)来研究干酪的蛋白质与其它成分的相互作用。I_MAX变化表示色氨酸含量的变化。色氨酸的这种荧光特性在疏水环境中和在亲水环境中有着显著的差异。I_MAX变化可反映色氨酸所处微环境的变化。荧光强度受水分、蛋白质、脂肪的影响。因此。运用色氨酸的荧光特性可以很好地监控再制干酪组分在分子水平上的相互作用。

(2)测试方法

　　① 取样测试时样品温度为(20+1)℃ ，用样品将内径为10mm的石英比色杯装满。

　　② 测试条件发射光谱305~400nm，激发光谱290nm，发射狭缝宽10 nm。激发狭缝宽10 nm，重复测试4次。

1.4 数据分析方法

　　利用SAS数据分析软件对实验数据进行方差分析和SNK多重比较，研究成分对融化性的影响； 同时对荧光强度、融化性进行相关分析。

2.1 涂抹型再制干酪成分测定

　　涂抹型再制干酪的水分含量、蛋白质含量、脂肪含量、pH 结果见表1。

　　由表1可以看出，样品问的水分、蛋白质、脂肪、pH 变化范围很大，其变化范围分别为46.72％~63.63％ 。8.31％~11.23％，16.05％~28.25％，5.31~5.65，且差异显著(P<0.01)。水分含量高的产品pH值较低(F品牌)。

2.2 融化管法测融化性

　　按1.3.2融化管法测定涂抹型再制干酪的融化性的结果见表2。

　　根据表2得出， 样品问的融化性差异极显著(P<0.01)。

2.3 荧光分光光度计法测融化性

　　按1.3.3荧光分光光度计测涂抹型再制干酪的融化性，结果见表3、图3。

2.4 融化管测定融化性与荧光分光光度计法测定融化性的相关性分析

　　由表2和表3 得出色氨酸 λ_MAX（出峰处的波长值）在335～350nm范围时，I_MAX与干酪的融化性成强相关性（R²=0.9425）（见图4）。I_MAX（最大荧光强度）与再制干酪的融化性成负相关。这与S K Garimella研究的结果相一致。

温度计| 温度表| 风速计| 照度计| 噪音计| 辐照计| 声级计| 温湿度计| 红外线测温仪| 温湿度仪| 红外线温度计| 露点仪| 亮度计| 温度记录仪| 温湿度记录仪| 光功率计| 粒子计数器| 粉尘计|
3 结论

　　3.1 色氨酸 λ_MAX在335～350nm范围时，IMAX与再制干酪的融化性成强相关性（R²=0.9425）。用荧光分光光度计法测定涂抹型再制干酪的融合性是可行的。
　　3.2 I_MAX与再制干酪的融化性成负相关。