一种用于乳酸检测的新型微流控芯片

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一种用于乳酸检测的新型微流控芯片

摘 要 基于光度吸收原理,设计了一种集成片上混合和光纤检测功能于一体的微流控芯片,用于细胞和组
织培养过程中乳酸代谢浓度的在线检测。通过光学设计软件( Zemax)优化设计了吸收光路,得到微流控芯片
沟道宽度为250μm,利用计算流体动力学软件(CFD)模拟确定了乳酸和显色剂片上混合时微流控芯片沟道
的溶液完全混合位置和光纤检测点,采用微电子机械系统(MEMS)加工了基于聚二甲基硅氧烷( PDMS)的微
流控芯片,将片上混合和光纤检测功能集成在一个以PDMS和载玻片组成的芯片上。实验结果表明,该芯片
成功实现了乳酸和显色剂的片上混合和实时检测,检出限(LOD)为0. 52 mmol/L ( 47 mg/L) ,乳酸浓度从
1 mmol/L变化至5 mmol/L时的芯片响应时间为130 s,能够满足细胞和组织培养过程中乳酸在线检测要求。
关键词 乳酸,微流控芯片,片上混合,光纤检测,微电子机械系统(MEMS)

1 引 言
基于微电子机械系统(MEMS)技术的生物微反应器在细胞和组织培养中显示出越来越多的优越
性,成为组织工程的研究热点[ 1~4 ] 。实时获取细胞或组织的生存状态是考察生物微反应器培养质量的
重要依据。生物微反应器中培养液的乳酸代谢浓度直接表征了细胞或者组织的活性[ 5, 6 ] 。因此,实现
对乳酸代谢浓度的直接、非接触及实时检测对生物微反应器而言具有重要意义。
电化学检测[ 7 ]和光度吸收法[ 8 ]为乳酸的常规检测方法。电化学检测需要电极和培养液接触,电极
的引入不可避免造成对培养液的污染,尤其是生物微反应器的培养液用量很少,易引起检测结果的偏
差。采用常规分光光度检测方法,则需要对生物微反应器培养液定期取样,取样间隔长短影响了检测精
度,无法精确获取细胞和组织的真实生存状态。
Wu等[ 9 ]根据光度吸收原理设计了一种光纤检测的微流控芯片,可以代替传统细胞培养过程中乳
酸代谢浓度的分光光度检测方法,实现了乳酸代谢浓度的非接触检测。但该芯片不具备乳酸和显色剂
片上混合功能,无法满足生物微反应器乳酸代谢浓度的直接、实时检测。在此基础上,本研究基于光度
吸收原理,研制了在一种集片上混合和光纤检测于一体的微流控芯片,实现了对乳酸代谢浓度的直接、
非接触、实时检测。频谱分析仪| 电池测试仪| 相序表| 万用表| 功率计| 示波器| 电阻测试仪| 电阻计| 电表| 钳表| 高斯计| 电磁场测试仪|
2 实验部分
2. 1 芯片设计
所研制的微流控芯片具有片上混合和吸收光度检测的功能,因此芯片由光纤光度检测器和微混合
器两部分组成。所设计的芯片结构如图1所示。Y型蜿蜒折叠沟道和光纤插入沟道均由聚二甲基硅氧
烷( PDMS)和载玻片组成,其中A,B, ., F为培养液不同更新速度时的光纤检测位置, I1、I2分别为乳酸
和显色剂入口,O为废液出口。
根据朗伯2比尔定律,当入射光波长和芯片沟道宽度一定时,透光率随乳酸浓度改变而变化。在所
设计的光纤光度检测器中,光源通过光纤耦合到PDMS膜壁,穿过培养液和PDMS膜壁再耦合到另一侧
 
光纤进入接收器。光传输过程中经过多个不同折射率的界面,势必会造成光传输的损失,降低检测灵敏
 图1 芯片结构示意图
Fig. 1 Structure ofmicrofluidic chip
A~F: 不同流速下的光纤检测位置( op tical fibre detecting po2
sitions under different flow rates) , I1, I2. 乳酸和显色剂的入口
( inlets of lactate and reagent) , O: 废液出口(outlet ofwaste ) 。
度。因此,获得较高的光传输效率成为设计的关键
之一。通过光学模拟软件对沟道宽度进行优化设
计,以期获得较理想的检测灵敏度。
微混合器按照是否采用动力分为主动式和被动
式两种[ 10 ] 。主动式混合器混合效果优于被动式,但
需要额外的动力,增加了芯片设计和加工的难度。
本研究选择了被动式混合器。混合器采用Y型蜿蜒
折叠沟道,通过流体的自扩散完成片上混合功能,采
用计算流体动力学(CFD)软件模拟计算出最佳混合
点位置,由此可确定光纤检测器的放置位置。
2. 2 芯片制作
微流控芯片由PDMS和载玻片组成,利用MEMS工艺制作而成。加工工艺主要包括SU8模具工艺
和PDMS工艺,如图2a所示。
首先在清洗干净的硅片上甩SU8 2100胶(美国MicroChem) ,厚度控制在150μm,利用掩模版在双
面光刻机(Karl SussMA6, 德国SUSS公司)曝光,显影后( SU28显影液,英国Ship ley Europe 公司)在硅
片上制成SU8模具。然后对SU8胶模具进行表面处理,将按照一定比例混合而成的PDMS ( Sylgard l
184, 美国Dow Corning公司)液体倒入模具中,在常温下凝固2~3 h。待PDMS凝固后将其从SU8模具
上剥离;在成型的PDMS微流控芯片上沟道末端位置开孔,采用R IE (反应离子刻蚀)对PDMS膜进行表
面处理[ 11 ] ,然后将其与清洗干净的载玻片通过化学键直接结合在一起,构成可逆封装(图2b) 。将光纤
插入芯片的光纤沟道,在显微镜下对准,使得光纤端部正好位于沟道两侧而不破坏沟道,如图2c所示。
这样即可获得具有片上混合和光纤检测功能的微流控芯片。
图2 加工工艺流程( a) 、微流控芯片( b) 和光纤与沟道结构( c)
Fig. 2  Microelectromechanical system (MEMS) p rocessing ( a ) , microfluidic chip ( b ) and the position
between channel and op tical fibre ( c)
2. 3 实验装置
采用中心波长568 nm的发光二极管(LED,美国Hewlett Packard公司)作为光纤光度检测器的激发
光源,通过光纤耦合器( ST,英国Afonics Fiberop tics公司)耦合到光纤(HFBR0410, 62. 5 /125 μm,美国
Agilent Technologies公司)端面,在另一侧通过相同的光纤及耦合器至光电二极管( PXR0108,英国Afon2
ics fiberop tics公司)作为接收器,由此光信号通过自制的微弱电流放大器转换为电压信号,通过12位数
据采集卡(ADC212,英国Pico Technology公司)送到PC机中进行记录。
2. 4 实验方法
所有的实验均在避光暗室中操作。为了获得精准曲线,取0、1、2、4和5 mmol/L乳酸各10μL,显色
剂( lactate reagent,爱尔兰Trinity Biotech PLC公司)各100μL。其它试剂均为分析纯。水为去离子水。
采用多路注射泵( PHD 2000,美国Harvard Apparatus公司)将乳酸和显色剂分别注入微流控芯片的
两个入口。精确调整注射泵管直径,使得乳酸和显色剂的进样速比为1∶10,满足乳酸混合显色需要。
第5期王军波等:一种用于乳酸检测的新型微流控芯片
在乳酸入口,依次注入0、1、2、4和5 mmol/L的乳酸溶液,待信号稳定后分别记录不同浓度下的输出响应。
3 结果与讨论
3. 1 光学模拟
利用光学设计软件(Zemax@ 10. 0)进行光学模拟,研究芯片沟道宽度对光传输效率的影响。
根据加工条件,选择PDMS膜壁厚度为0. 07 mm,折射率为1. 45,所用乳酸近似为水溶液,折射率为
 图3 沟道宽度对的光纤传输效率的影响
Fig. 3 Effect of channelwidths to transmittance efficiency
1. 33。光纤孔径0. 4, 0. 8 mmi. d. 、1. 5 mm o. d. ;发
光二极管LED光源中心波长568 nm。
光学模拟结果如图3 所示。可以看出,随沟道
宽度增加,光纤传输效率降低。当沟道宽度< 300
μm时,光传输效率> 90%。考虑增大沟道宽度可以
提高检测灵敏度,兼顾加工工艺因素,选择沟道宽度
为250μm,传输效率为0. 91。
3. 2 沟道内溶液混合的流体动力学模拟
利用计算流体动力学( computational fluid
dynamics, CFD)软件( FLUNENT@ 6. 2)进行乳酸和
显色剂在沟道内的溶液混合模拟,研究沟道长度对溶液混合效果的影响。
根据芯片的加工条件和上述优化设计的结果,沟道宽度250μm,深150μm。按照生物微反应器中
培养液更新速度要求,计算培养液流速0. 1~2μL /min范围时乳酸和显色剂能够完全混合完毕时的沟
道长度。
芯片设计乳酸和显色剂沟道宽度相同。为满足光度吸收乳酸和显色剂1∶10体积比例要求,乳酸和
显色剂的流速比1∶10,即显色剂的流速范围1~20μL /min。
通过CFD软件模拟计算,得到乳酸流速与完全混合完毕所需沟道长度的关系曲线,其线性回归方
程为:
L = 65. 947v + 0. 0003 (1)
其中, L 为沟道长度(mm) , v为乳酸流速(μL /min) 。回归方程相关系数r = 1. 000。可见沟道长度和乳
酸的流速成正比,即和培养液的更新速度成正比。也就是说培养液的更新速度越快,所需的沟道长度越
长。
3. 3 显色反应时间对沟道长度的影响
实验表明,乳酸和显色剂完全混合后需一定显色反应时间达到光度检测的最佳值。2 mmol/L乳酸
和显色剂完全混合后,反应时间和检测信号之间的关系如图4所示。所采用的检测仪器为分光光度计
可以看出,在完全混合后较短的时间内,光度吸收率迅速上升,达到一定吸收率后随时间延长而降低。
因此,选择完全混合后光度吸收率最高值对应的时间为最佳检测时间(6 min) ,计算出不同流速下
的所需要的完全混合并反应充分的沟道长度,获得不同流速下的光纤检测位置。图5为芯片不同位置
乳酸和显色剂混合效果的显微图像(乳酸和显色剂的流速分别为0. 1和1. 0μL /min) 。
3. 4 检出限和响应时间
为检验微流控芯片的混合效果和检测灵敏度,分别采用96孔板和微流控芯片进行溶液混合和检
测。微流控芯片的乳酸检测校准曲线回归方程为:
ychip = 0. 176c - 0. 1141 (2)
孔板混合后的检测校准曲线回归方程为:
y96 p late = 0. 0652c + 0. 0522 (3)
以上两式中, ychip和y96 p late分别为微流控芯片和96孔板无量纲检测相对值, c为乳酸浓度(mmol/L) ,回
归方程的相关系数分别为0. 9925和0. 9902。实验表明,微流控芯片混合和检测结果显示出更好的线
性度,灵敏度(0. 176 mmol/L)也明显高于96孔板(0. 0652 mmol/L) 。

 图4 吸光度与反应时间关系
Fig. 4  Relationship between absorbance and
reation time
 图5 芯片入口处( a) ,中间段( b)和检测点附近( c)的显微图
Fig. 5 Microscopy ofmixing on chip at the inlet position ( a) , the
middle position ( b) and near the detection point ( c)
图6a为采用微流控芯片测试不同乳酸浓度的梯度曲线。根据信号检测3σ原则,计算出微流控芯片
的检出限(LOD)为0. 52 mmol/L (47 mg/L) ,可以满足细胞培养过程中乳酸代谢浓度检测的精度要求。
图6b为采用微流控芯片时系统的响应时间。先后通入1和5 mmol/L浓度的乳酸,可以发现130 s
后即可检测到乳酸浓度的变化,可以满足检测的实时性需要。

发布人:2010/8/11 10:42:003485 发布时间:2010/8/11 10:42:00 此新闻已被浏览:3485次