一种应用于液相色谱分析和基质辅助激光解吸附质谱分析的微型分散器 摘要: 一种含有聚合物整体柱且能够调节液滴的压电装置用来将蛋白质酶解产物的洗脱液点样到基质辅助激光解吸附质谱（MALDI-TOF-MS）样品靶上进行肽段指纹图谱分析。牛血清白蛋白（BSA）酶解肽段经过液相梯度洗脱后可以提高序列覆盖率和蛋白质鉴定的可信度。
肽段指纹图谱（PMF）是一种基于肽段质量检测的蛋白质鉴定的质谱技术，常用于药物靶点和生物标记物发现的差异表达分析中[1,2]。PMF实验的效率与蛋白质酶解肽段片段被鉴定的数目相关。当细胞和组织的量受限制时，在样品中的蛋白质浓度降低的同时保证蛋白质鉴定的可信是目前研究的挑战之一。由于高低丰度分析物离子的竞争造成肽段检测数目降低的问题更加严重[3,4]，这将引起离子抑制以及减少低丰度肽段和蛋白质的检测数量，从而降低目标蛋白质的序列覆盖率。在质谱分析中，微型液相色谱（LC）分离可以明显地提高肽段和蛋白质样品的检测灵敏度[5-7]。液相色谱分离技术可以将高低丰度的蛋白质分开，降低检测过程中的离子抑制效应[8]，从而可以提高目标蛋白质的序列覆盖率。多样的微型液相色谱分离模式可以单独运行也可以与其他如亲和捕获、离子交换、体积排阻色谱聚焦和反相色谱模式联用[9-11]。 气体
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温湿度记录仪 PiezoLC（MicroFab Technologies, Inc., Plano, TX, 专利申请中）是一种微量喷射进样系统，用其可以将经色谱分离的微量体积（0.1~100 nL）蛋白质酶解肽段点到基质辅助激光解吸附质谱（MALDI-TOF-MS）的样品靶上供后续的质谱分析。一种多孔的聚合物整体材料固定在玻璃毛细管的喷射分散装置上用来进行肽段的色谱分离。这些肽段样品首先进样到整体色谱柱上（反相基质），然后洗脱缓冲液流经色谱柱时将肽段洗脱分离。洗脱的肽段以液滴的形式从压电的装置孔出来，点到MALDI-TOF-MS的样品靶盘上，仍然保留着色谱分离后的状态。肽段将在一定时间后进行多重分析。
PMF分析中，蛋白质和肽段的量往往受到限制，需要微型化的流体操作技术。PiezoLC喷射进样装置采用一根聚合物整体柱并且只需要很少体积（<10μL）的蛋白质酶解产物。甲基丙烯酸基质的聚合物分离材料不需要填充颗粒填料和筛板，很难被整合到微小流速的装置中并且会干扰液流[12]。大孔聚合物整体材料的反压低，这对于系统分散装置来说极其重要。通过紫外光引发聚合可以为整体柱固定形状和位置。多种化学物和功能单体可以被整合到一根整体柱上，如强阳离子交换（SCX）和反相（RP）。不仅如此，这些色谱柱具有的快速传质能力，使得其具有强大而快速的分离能力[13]。
PiezoLC装置是一种非常有用的工具，能够从有限的样品中对蛋白质进行鉴定和表征。PMF应用实验中肽段采用喷射系统进样进行色谱分离后可以明显地降低离子抑制效应并且提高MALDI-TOF-MS的分辨率。对牛血清白蛋白（BSA）的酶解产物进行分离分析时，与对照组相比，该方法鉴定了大量的肽段，具有非常高的氨基酸序列覆盖率，提高了蛋白质鉴定的可信度。
1 方法 1.1 BSA溶液的酶解
BSA蛋白质溶液酶解过程按照Kinter等人[14]的方法进行。将蛋白质与20μg的胰蛋白质酶（Promega, Madison, WI）混合后在37 ℃条件下反应过夜。
1.2 整体柱的制备 （1）硼硅酸盐基质的玻璃毛细管乙烯化。整体聚合物（丁基甲基丙烯酸-乙烯二甲基丙烯酸） 毛细管柱按照Lee 等人[15]的方法制备。PiezoLC硼硅酸盐基质的玻璃毛细管的内表壁需要乙烯化用来共价连接整体聚合物。
（2）混合物的聚合。乙烯化的硼硅酸盐基质的玻璃毛细管利用不透光的绝缘带掩盖并充满以下聚合混合物：16%（v/v）乙烯二甲基丙烯酸，24%（v/v）丁基甲基丙烯酸，59%（v/v）1-正癸醇以及1.0%（v/v）2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。充满聚合混合物的毛细管在ELC 4001（Electro-Lite Corp., Danbury, CT） 365 nm 15 mW/cm2 紫外灯下照射15 min。反相聚合物整体材料的孔径经测定为2.2μm。
（3）PiezoLC微型分散装置的构建。含有整体材料的玻璃毛细管装配到PiezoLC微型分散进样装置中（见图1）。不同的整体柱位置对应于不同的分散孔进行了多种分散测试。在液滴形成和分散过程中干扰最小的整体柱在毛细管中的位置如图2所示。
1.3 洗脱实验 （1）基质溶液。将重结晶的α-CHCA（α-cyano-α-hydroxycinnamic acid）（LaserBio Labs, Sophia-Antipolis, France）溶解于350 g/L溶液中，其中含有等量的1-丙醇、甲醇、1-丁醇和乙腈（Sigma-Aldrich）。利用带有55μm喷射孔（PN MJ-AT-01-55, MicroFab Technologies, Inc.）的PiezoLC微型分散进样装置，将含有0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）的α-CHCA溶液沉积在不锈钢的MALDI样品靶盘上（PN DE1271TA，Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD），每个点为100 nL。
（2）色谱柱上样。PiezoLC装置用200μL 70%（v/v）乙腈和0.1%（v/v）TFA冲洗，然后再用200μL 0.1%（v/v）TFA冲洗。BSA的酶解产物（50 fmol/μL）上样到柱上，然后再用200μL 0.1%（v/v）TFA冲洗。
（3）梯度洗脱。梯度洗脱程序为浓度每次变化5%，从5%增加到70%。这一过程采用包含等量的1-丙醇、甲醇、1-丁醇、乙腈（Sigma- Aldrich）溶液和0.1%（v/v）TFA溶液（EBD1洗脱缓冲液）来实现。每个洗脱步骤以6.0μL/min的流速将体积为100 nL的洗脱液过量的上样到12 个基质靶点。以70%的EBD1作为洗脱缓冲液时等度洗脱的BSA酶解产物作为参照。
（4）MALDI-TOF-MS和PMF。在反射模式下进行MALDI-TOF-MS分析实验，所用仪器为Axima CFR MALDI-TOF质谱仪（Shimadzu Scientific Instruments），每个样品点100张谱图，并且每张图10个激光点叠加产生。光谱通过质量为1439.811 7 Da和2 045.027 9 Da的两个肽段进行内标校正。峰形平滑方法为Savitsky-Golay法，其带有梯度质心峰抓取方法。将利用Axima软件生成的单一同位素质量产生的数据，上载到MASCOT PMF搜索软件中进行分析[16]。SwissProt数据库搜索时采用多种修饰（脲甲基半胱氨酸修饰）并且其肽段质量容忍度为±0.2 Da。
2 结果 2.1 MALDI-TOF-MS谱图
图3显示的是所有从PiezoLC装置中经每个台阶梯度洗脱下来的BSA酶解产物的MALDI-TOFMS谱图，其采用的梯度条件为5%~70%的EBD1 洗脱液。
在对照组的等度洗脱中，序列覆盖率和被鉴定的肽段数分别为30%和17。采用台阶梯度PiezoLC分离的同样量的BSA酶解产物，得到的结果为序列覆盖率为56%，总共鉴定出38个肽段（图4）。与对照组相比，该方法的序列覆盖率提高了87%，鉴定的肽段数提高了124%。在50%，55%，65%和70%的台阶洗脱中经MASCOT软件搜索后没有发现明显的与BSA蛋白质相对应的肽段。这些结果与其他的PiezoLC BSA产物洗脱实验的结果一致。
3 结论 一种含有聚合物整体柱且能够根据需要点样的装置用来将蛋白质酶解产物的洗脱液点样到MALDI-TOF-MS样品靶上进行PMF分析。经过台阶梯度洗脱方法对BSA酶解产物进行LC分离分析时可以提高序列覆盖率和蛋白质鉴定的可靠性。这种微型方法非常有利于PMF的蛋白质酶解样品分析中低浓度的蛋白质的PMF分析，为蛋白质组样品分析提供了新的装置。
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