生物电化学传感器测定农药残留的研究进展

生物电化学传感器测定农药残留的研究进展 

 摘要：生物传感器在环境监测方面具有灵敏及便于携带等优点。 以胆碱酯酶的催化活性为基础的抑制型酶电极和以有机磷水解酶 (OPH)为基础的直接测定型酶电极近来研究广泛、发展迅速。本文 通过对传感器原理以及近1O年酶固定技术的发展的叙述，总结了各 种电化学传感器的优缺点，提供了酶生物传感器在测定有机磷农药残 留的最新研究进展。 关键词：环境工程；传感器；酶；电化学；有机磷农药 中图分类号：O 657．1：TO 45 文献标识码：A O 引 言 农药是当前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害 不可缺少的物质，对促进农业增产有极其重要的作用。据联 合国粮农组织报告，1995年全球的农药销售量达120万Tl】 。
我国自1993年开始禁用有机氯农药以来，有机磷农药被广泛 浊度计| 色度计| 粘度计| 折射计| 滴定仪| 密度计| 热流计| 浓度计| 折射仪| 采样仪| 用于农作物病虫害的防治。据统计1999年我国的农药产量 为4o万T，其中70％ 为杀虫剂。杀虫剂中有机磷农约占 70％ 。一方面有机磷农药相对于有机氯等农药，具有高效，低 生物累积和降解较快 一等优点，另一方面长期使用有机磷农 药不仅会对环境生态系统造成影响，而且其还可以在食物链 中累积、浓缩，进而进一步危害人体的身体健康。有机磷农药 对人体的神经系统有不同程度的影响，轻则引起头痛、恶心、 呕吐，重则引起肌肉乏力和呼吸困难，接触过多甚至会引起死 亡3；因此发展简便、快速的现场分析技术对环境监测、食品 安全及军队防御等方面有积极意义。 传统上二有机磷农药分析方法主要是利用气相色谱、液卡H 色谱、薄层色谱、高效液相色谱以及各种光谱连用技术 “ 。
虽然这些方法的选择性、灵敏度和准确度高，佴其需要昂贵的 仪器设备，样品的前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的 技术水平要求很高，不适于现场检测。 1962年Clark 提出利用酶的特异性，把它和电极组合起 来用于测定酶的底物的原理。1967年updike等 一成功地利 用其假设研制出用于葡萄糖测定的生物传感器以来它的发展 非常迅速。生物传感器通常是指由一种生物敏感部件与转化 器紧密配合，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择 性和可逆响应的分析装置。传感器的牛物敏感膜与复杂样品 中特定的目标分析物之间的识别反应会产生一些物理学信号 的变化。这些变化通过不同原理的转化器转换成第2信号， 经放大后显示或记录。它以其简单、快速、灵敏、低成本和便于携带等优点弥补 传统分析技术的缺点，尤其是以胆碱酯酶(ChE)的催化活 性为基础的抑制型酶电极和以有机磷水解酶(OPH)为基础 的直接测定型酶电极已大量用于有机磷的检测，如荧光检测 生物传感器 “j、光导纤维生物传感器

一、压电晶体生物传感 器0 、半导体器件生物传感器[14 J、光热检测生物传感器 s] 等。在检测有机磷的传感器技术中，电化学生物传感器研究 较为广泛，发展迅速。本文主要综述有机磷电化学生物传感 器的研究进展。
1 胆碱脂酶生物传感器 胆碱脂酶测定农药残留的工作原理是，酶催化底物乙酰 或丁酰胆碱在胆碱脂酶的催化作用下分解形成胆碱和有机 酸，如反应(1)。有机磷及氨基甲酸酯类农药是底物胆碱的结 构类似物。它们同胆碱酯酶作用时，首先形成非共价的中间 复合物。此复合物很不稳定，极易水解。水解的同时，磷酰基 与胆碱酯酶活性中心丝氨酸羟基作用生成以共价结合的磷酰 化酶，如反应(2)，使酶的活性降低，水解反应被抑制，反应产 物减少。而溶液pH值的变化以及胆碱在胆碱氧化脂酶的氧 化下生成的过氧化氢的浓度的改变或反应中氧的消耗量能被 电化学传感器测定。 0 I ～ 一 + CI BuChE cH3- (CH2)2mCmO(CH2)2一N(CH3) butyrylcholine chloride 一 + Cl CH3一(CH2)2一C00+H +H0一(CH2)2一N (CH3)3 (1) butyric acid choline 0 inhibiti0n Enz— Ser一0H+CC13CH2O— P一(OCH3)2 — 0 Enz— Ser—O— P一(OCH3)2+CC13CH20H (2) trichlorfon 1．1 电势型生物传感器 反应(1)产生的酸电离使得缓冲溶液的pH值发生改变， pH值的改变可以通过离子选择电极(玻璃电极、金属和金属 氧化物电极)和ISFET进行测定。pH值的变化量与农药对酶 的抑制率即农药浓度成比例，从而可以间接测定农药残留。 近年来报道了使用聚苯胺作为转换物质测定pH值的变 化 。此电极的优点在于：在pH值3—9的范围内，每个 DH的变化量可引起90 mV电势的变化。 自从20世纪80年代首次将此技术应用于农药残留分析 以来[ 一，人们一直在不断地在酶的固定化技术、基底电极的 选择以及电极的修饰等上进行改进。目前对酶的固定技术方 法已有较深的研究，提出了夹心法、吸附法、共价键合法、凝胶 ／聚合物包埋法、交联法以及LB膜技术一 19]。Kumaran等 ∞ 将丁酰胆碱酯酶交联在预活化了的尼龙一聚酰胺膜上，用尼 龙网将载酶膜片固定在pH电极表面，测定土壤萃取液中乙基 对硫磷、速灭灵和二嗪磷的检出限分别为3．9 ug／g、1．4 ug／g和35 ng／g。Campanella等 在外套聚四氟乙烯的石墨棒顶端覆 盖一层含PVC PVA PVAc、增塑剂癸二酸盐以及离子载体三 (十二烷基)胺的聚合体膜(此膜对H 敏感)，另用碳化二亚胺 (carbodiimide)将丁酰胆碱脂酶交联固载在尼龙膜上，并用透析 膜及O型圈将其固定于H 敏感膜上，能测定质量浓度为1．0 L的对氧磷。Ivanov等_2 调查了锑电极及玻璃电极对有机 磷杀虫剂敌百虫检测限的影响，根据酶的种类、来源和固定方 法的不同，分别把来自电鳗的乙酰胆碱脂酶和来自马血清的丁 酰胆碱脂酶直接固定在锑电极表面以及商品化的尼龙或硝酸 纤维素膜上，检出限分别是0．01 mg／I 和0．07 mg／L。Snejdarko— va等t 将乙酰胆碱脂酶交联固定在被聚苯胺修饰过的金电极 表面测定敌百虫和克百威。由于聚苯胺可以提高金电极对 H 的灵敏度，使检出限分别达到200 nmol／L和6 nmol／L。 ENFET是将酶以共价结合的方式固定在pH—FET的栅极 绝缘膜上。酶催化酶底物发生水解反应生成酸，酸电离成氢 离子，这样就可以引起栅极电流的变化，再通过漏电流的变化 测定信号l 23一。Dumschat等 J把乙酰胆碱脂酶涂覆在FET的 栅极绝缘膜上， 用预先浓缩就可以测定敌敌畏浓度范围在 0．3～1．2 mg／L的水样。Nyamsi Henri等一 将胆碱脂酶、牛血 清蛋白和甘油溶于磷酸盐缓冲液中，然后将此混合液滴涂在 清洗好的彭pH—ISFET的栅极上，在参比FET上滴上不含胆碱 脂酶的上述混合液，然后在饱和戊二醛蒸气中交联反应25 min，通过测定两电极之间的输出信号差别，可以检测到l0 mol／L的二异丙基氟磷酸(DFP)。Wan和Nicole等_“ 一比较 了3种不同酶的周定方法的分析特性(见表1)，发现它们在 酶促反应常数以及电极的寿命、检出限等方面有所不同：
1．2 电流型生物传感器 反应(1)中底物用硫代乙酰胆碱代替乙酰胆碱，生成的巯 基胆碱可被氧化而产生电流。以此可设计成电流型生物传感 器：如果同时使用胆碱脂酶和胆碱氧化酶，则胆碱氧化酶氧 化反应所消耗的氧或生成的过氧化氢也可被检测，以间接测 定有机磷农药残留浓度，如反应(3)。 ChO choline + 202+ H20 betaine + 2H2O2 H2O2— 2H +O2+2e一 (3) b Rosa等 用戊二醛、牛血清蛋白与乙酰胆碱脂酶交 联固定在尼龙膜上，然后将载酶膜固定在玻碳电极表面制成 生物传感器，用乙酸一4一氨基苯脂做底物，在250 mV与饱和 汞电极下测定对氧磷和西维因，最低检测浓度可达4．0 nmol／L和13．0 nmo~L。 由于酶电极中绝缘的蛋白质基质阻碍了电极表面与氧化 还原酶的活性点问的直接信号通讯，第2代酶生物传感器 使用扩散电子转移介质来从中导通蛋白质氧化还原点和电极 表面间的通讯。Martorell等_3 研究设计了一种只需简单抛光 就可以重复使用的酶传感器。他将碳粉、非导电性环氧树脂、 有机盐电子媒介体四氰基对醌二甲烷(TCNQ)、酶(AchE或 BChE)的混合液固定在胺化了的硅石粒子(硅石粒子已被硅烷 化)上，以巯基乙酰胆碱或巯基丁酰胆碱(ATCh或BTCh)做底 物，在pH：7．5的0．1 mol／L磷酸盐缓冲液+0．1 mol／L KCI，300 mV及以Ag／AgO 为参比电极条件下测定对氧磷，最低检出限分 别为27．5 L(AchE)和2．8 L(BchE)。此传感器的优点在 于：由于在电极上修饰了氧化还原电子媒介体，底物的电催化氧 化可在较低的电势下进行，从而减少了其他电活性物质的干扰。 近年来越来越多的研究注重在印刷电极传感器上。此电 极的优点是成本低，可大规模生产和便于携带，非常适合实时 及在线监测。研发印刷电极的关键点是生物受体在电极表面 的固定技术；因为适宜的固定方法不仅能提高电极操作和贮 存的稳定性，缩短响应时间，还能提高线性范围和灵敏度。 Gogol等 ]事先将l层nation膜覆盖在印刷电极上，然后将马 血清丁酰胆碱脂酶在戊二醛饱和蒸气下交联在此膜上。对敌 百虫、蝇毒磷的检出限分别为3．5×10一mol／L和1．5×10。 mol／I 。与其他没有经nation膜修饰的电极相比，它有稳定性 高，工作电势低，灵敏度不受影响等优点。Andreescu等_3 对比 了3种不同酶固定方法对分析特性及农药检测的影响(见表 2)：第1种方法是将酶电聚合在聚合膜上，即首先将石墨、TC． NQ和HEC涂覆在工作电极表面，然后再将酶和PVA—SbQ固定 在此膜上；第2种方法是直接把石墨、TCNQ、HEC、凝胶溶液以 及酶的均匀混合液滴涂在工作电极表面，即将酶生物包埋在凝 胶层中；第3种方法是先将石墨、TCNQ、HEC和silica—NTA—Ni 涂覆在工作电极表面，然后再将酶固定在此膜上，即将酶用金 属螫合固定。当酶的抑制率在10％ 时，可以分别检测出1．5× l0一mo1／I⋯1 5×10 mol／L和4．1×10一mol／L的敌敌畏。 表1 不同膜修饰电极分析特性一览表 Table 1 Analytical Features of Different Biosensors 表2 不同酶固定方法的分析属性一览表 Table 2 Analytical features for diferent method of enzym e immobilisation *实验条件：0．1 mol／L磷酸缓冲液+0．1 moL／L KC1，pH：8．0： ：【作电压100 mV，以Ag／AgC1为参比电极；1 mmol／L巯基乙酰胆碱为底物魏福祥等- 用橡胶环将载酶硝酸纤维素膜固定到银基 汞膜电极 ，与饱和甘汞电极、铂对电极组成三电极测试系 统。在抑制率为5％ 时，测定敌敌畏的检出限是2．8×10 。 molfL，并且分析周期短，只需40 min，非常适宜进行现场快速 监测：Neufeld等 -将流动注射技术与传感器结合，设计了一 种微量流动注射电化学生物传感器。电化学测量系统包括1 个同定了载酶尼龙网的印刷电极，1个自制的流动注射系统 以及一台计算机。使用硫代乙酰胆碱作底物，其与六氰合铁 酸盐在 【作溶液l{】反应，把[Fe(CN)6] 还原成[Fe(cN)6] 。 ：Fe(CN) ] 一的再氧化能使电极产生尖锐、快速、再现性好的 电信号，在3 min内可以测定5 ng的敌敌畏。 Ciucu等 在用femphthal0cvanine修饰过的碳糊电极卜 定少量的乙酰胆碱脂酶和胆碱氧化酶，在350 mV Ag／AgCI参 比电极条件下测定被氧化酶氧化生成的H，O，的变化以得出 农药的含量。用此方法町以测定l0 。mol／I 的对氧磷和呋 喃丹
1．3 电导型传感器和电流型传感器的比较 一般来说电流型传感器的检出限要比电势型的低，见表 3 。这是因为电势型传感器测定的足H ，而缓冲溶液具有 不同的缓冲能力，削弱了H 的响应。 尽管安培型牛物传感器被认为测定快速且灵敏度、准确 度高；但电势型传感器的使用仪器普遍、小巧，便于携带，冈 此更适合野外监测： 目前对食品中农药残留的分析主要集中 在电流型生物传感器上 Schulze等一 在修饰r羟乙基纤维 素(HEC)、TCNQ一石墨的厚膜电极上，用戊二醛交联法在其 上固定人工合成乙酰胆碱脂酶及电鳗乙酰胆碱脂酶，在pH： 7．5的10 mmolfI 磷酸钾缓冲液和0．05 mol／L NaCl溶液的混 合液中，孵化30 min，100 mV及Ag／AgCl参比电极条件下测定 婴儿食品，能够检测到低于5 g／kg的农药残留 表3 电导型和电流型传感器测定有机磷及氨基 甲酸酯类农药的检出限对照表 Table 3 Detection limits of potentlometrlc and amperometric biosensors for diferent pesticides 农药 检出限／(g·L ) 电势型(pH传感器) 电流型(硫代胆碱氧化) 涕灭威 1 140 1．9 西维因 l 000 19 呋喃丹 6 0 02 敌敌畏 300 22 1．4 酶活性的再生 用胆碱脂酶测定农药残留是利用农药对酶活性点的抑制 原理，因此在测定完毕后，怎样恢复酶的活性，使传感器能反 复使用成为一个问题。目前多使用2一PAM进行再生。Gulla 等 一提出用TMB一4代替2一PAM，并作了对比试验，发现用 TMB一4进行再生， 反复使用11次后酶仍能保持60％ 原来 的活性，而用2 PAM在6次以后酶的活性不到原来地50％ 。 2 有机磷水解酶生物传感器 对于胆碱脂酶传感器，由于酶 仅对有机磷有抑制作用， 同时也对氨基甲酸脂类农药有抑制作用；因此它测定的是一 总体含量，选择性较差。另外在测定时需要同时测定抑制前 后的信号，并且孵化时间较长(一般需l0～15 min，甚至更 长)，这样整个分析过程比较长。而有机磷水解酶只对有机磷 农药有催化水解作用如反应(4)，传感器直接测定水解产物； 因此与胆碱脂酶抑制法比较起来，此法简单、快速。 Mulchandani等 将含有机磷水解酶(OPH)、BSA和戊二 醛的混合溶液直接涂覆在pH电极的玻璃膜表面，交联固化 30～40 min，然后用渗析膜包裹住酶层形成酶电极，最低能检 测2 M的对氧磷、乙基对硫磷、甲基对硫磷和二嗪磷。虽然 此电位刑传感器制备较简单；但酶需要分离提纯，整个过程 费时费力，成本高。 Mulchandani等· 又制作了用碳电极作为基底电极的电 流型酶传感器。
原理是反应(4)水解产物能在电极的阳极上 产 电化学氧化，其产生的电流与农药浓度成正比。他们用 印刷技术制作条形厚膜碳糊电极，并将含OPH的nation溶液 滴涂在电极表面。此传感器的灵敏度比电势型的高，对氧磷 和甲基对硫磷的检出限分别达到9×10 mol／L和7×10 mol／I．。另外此传感器还显示出有意思的动力学特性：一方 面只需要10 S便能得到稳定的电流，检测时间短；另一方面 其重现性好，对浓度为4．6×10 mol／L的对氧磷进行l2次 计时电流的重复测定，相对偏差只有1．9％。 生物传感器与流动注射技术的联合是一大势和研究热 点：两者的结合能使检出限降低，适宜于环境监测、食品分析 和临床检测等。Wang|4 一等将经过电活化的金电极浸入胱胺 溶液，氮气吹于，然后在胱胺表面交联上OPH。此电极与流动 注射系统相连，能够得到快速、灵敏和稳定的响应，并且它的 选择性也非常好，测定对氧磷和甲基对硫磷的线性范围在l ～ 10 mol／I，，对氧磷的最低检出限为0．1 tool／L。 3 结 论 有机磷农药的大量使用对环境生态系统破坏以及对人体 健康的影响越来越引起人们的重视。适于野外快速监测，减 少有机溶剂使用量，测试费用低廉的分析方法亟待开发，以生 物受体作为分子识别元件的生物传感器正适应于此要求。近 年来此类传感器技术取得了很大的进步，测定的灵敏度越来 越高，响应时间越来越短，电极寿命越来越长；然而方法的选 择性差和生物材料的失活问题阻碍了它的商品化、市场化发 展。相信随着生物以及微电子等技术的快速发展，此类传感 器将会有光明的应用前景。