生物显微镜的基本结构和光学性能

生物显微镜的基本结构和光学性能

显微镜的基本结构可分为光学系统、光源照明系统和机械装置三部分。下面分别对它们予以介绍。

一、生物显微镜的光学系统

        显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、聚光镜和光源系统四个主要部件。其次还包括滤光片、载玻片和盖玻片。
（一）物镜
        物镜一般都是在物镜转换器上旋着。它是显微镜的最主要部件。显微镜的放大及分辨作用主要由它来担当。其优劣直接决定了显微镜的主要光学性能。普通物镜的结构如图1所示。

图1 物镜的结构

        为了校正像差和色差（所谓像差是指所成的像与原物在形状上的差别，色差是指所成的像与原物在颜色上的差别），物镜都由多块透镜组成，而且放大倍数越高，结构越复杂。
         普通物镜所观察到的像面总有些弯曲，即靠中间部分清晰，靠边缘部分比较模糊。要想让边缘清楚，需要调节显微镜的微调钮。但是边缘部分清楚后，中间部分又变得模糊了。这除了不便观察外，更主要地是无法对其进行摄影。平场物镜可以较好地校正像面弯曲，使视场平坦。但其结构也相应地复杂些。
        现在，多数高倍物镜和油镜内都装有弹簧。在物镜前端受压时，镜头可以退缩回来。这样一方面可以保护镜头，另一方面也不会把载玻片和盖玻片压碎。这种物镜称为弹簧物镜。
 １、物镜的分类  显微镜的物镜虽然细分起来多达数百种，但是一般可采用下述三种分法：
        （１）按物镜使用空间介质的不同可分为：
        干燥系物镜：使用时，物镜与标本之间以空气为介质。
        油浸系物镜：简称油镜。使用时，物镜与标本之间以油类为介质。
        （２）按物镜的放大倍数不同，可分为：
         低倍物镜：放大10倍以下；
         中倍物镜：放大10～25倍：
         高倍物镜：放大40～80倍；
         油镜：放大倍数一般为100倍。　
         （３）按物镜对像差和色差的校正程度不同，可分为：
         消色差物镜（ACH）；
         复消色差物镜（APO）；
         平场消色差物镜（PLAN ACH）；
         平场半复消色差物镜；
         平场复消色差物镜（PLAN APO）。
         这五种物镜的区别主要是消除色差与校正场曲的程度不同。其性能和复杂程度均是递增的。即平场复消色差物镜质量最好，但其价格也最高，结构也最复杂。
２．物镜的识别 
        物镜通常都标有表示物镜光学性能和使用条件的一些数字和符号。如“40/0.65”和“160/0.17”。此处的40表示它的放大倍数（有的写成40×或40：1）；0.65表示它的“数值孔径”（有的写成N.A.0.65或A. 0.65）；160表示使用该物镜时，显微镜的机械筒长应为160mm（所谓机械筒长是指取下物镜和目镜以后，所剩下的镜筒长度。显微镜的机械筒长现已统一规定为160mm）；0.17表示使用该物镜时，盖玻片的厚度应为0.17mm。有些低倍物镜，在有、无盖玻片的情况下都可以使用，所以不标0.17 而代之以横线“－”。有些油镜上标有“油（或oil）”字。
（二）目镜
        普通目镜的结构如图2所示。目镜通常插在镜筒上。根据需要可以方便地拔插更换。其作用是把物镜放大后的像作进一步的放大，使人眼能够清楚地观察标本。它有单目和双目两种工作方式。廉价显微镜多采用单目形式，使用时，只能用一只眼睛观察。双目显微镜配有两个相同的目镜，可供两只眼睛同时观察。一般的目镜是由上下两块或两组透镜组成。下面的一块大透镜叫场镜，上面的一块小透镜叫接目镜。两块透镜之间有一个环状光栏，用它来限制视场的大小，只留下成像质量较好的像供观察，通常把它叫做视场光栏。光栏上一般粘有一个细丝，用来指示特定的观察目标。当此细丝掉下后，可粘一小段头发或细铜丝代替。但要注意，其尖端要落在光栏平面内。否则，观察时，指示不清晰。

图2 目镜
1、接目镜 2、指针 3、视场光栏 4、场镜

       目镜可分为惠更斯目镜、冉斯登目镜、平场补偿目镜、平场广视野目镜和其它特殊目镜等多种。其中，上下两块透镜的凸透面都朝下的惠更斯目镜在普通显微镜上用得最多。平场补偿目镜一般标有“p”，国产也有标有“PB”的。它和平场物镜相配用。属于高档目镜。
（三）聚光镜
       聚光镜又叫集光器，一般安装在镜台下面。它由手旋螺丝固定，安装方便。通常，它由聚光镜和可变光栏两个部件组成。有的聚光镜的下方还安装有一个放置滤光片的圆环形架子。聚光镜的作用一是将光源来的光线会聚到标本上，以便观察。二是使照明光线获得一个与物镜数值孔径相适应的孔径角，以保证物镜充分地被利用。普通聚光镜的结构如图10-2-3所示。可变光栏又叫光圈或虹彩光栏，装在聚光镜的下方，由十几块金属薄片组成。中央通光孔为圆形，移动可变光栏的把手，可以任意调节通光孔的大小。改变聚光镜的孔径角，以配合物镜的数值孔径。
       聚光器的主要参数是数值孔径。但它的数值孔径是可变的，受光栏孔的大小控制。光孔开大，数值孔径增大，反之则减小。聚光镜外壳上所标的是数值孔径的最大值。
       整个聚光镜安装在支承架上。支承架是由滑板连接，利用齿轮齿条，作高低升降够动。聚光镜的光轴应和显微镜物镜的轴重合。当发现偏差时，可调节聚光器支承架两侧的中心调节螺钉，使二者重合。
       除了上述普通的聚光镜外，还有暗视场聚光镜、相衬聚光镜、偏光聚光镜等多种不同用途的聚光镜。以满足不同场合的使用。
       有的显微镜在镜座部分还有一个聚光镜，此聚光镜仅仅起普通的会聚光线的作用。
（四）其它
1、滤光片 
       有些显微镜配有不同波长的滤光片供选用。显微镜所用的滤光片通常为几个毫米厚的有色玻璃片。滤光片可以滤出与其本身颜色相同颜色的光。使用不同的滤光片，可以有选择地使用不同颜色的照明光线，使观察效果更佳。滤光片常被放置在聚光镜最下方的圆环内，也有的放置在底座上。
2、载玻片和盖玻片
       顾名思义，载玻片是用来承载样本的，盖玻片是用来复盖样本的。即，通常观察标本时，标本被夹在两块玻璃片之间，下面的一块叫载玻片，上面的叫盖玻片。二者一般是用长方形的透明玻璃片制成，只是薄厚有所区别。标准盖玻片的厚度为0.17mm；载玻片的厚度则为1.1mm。即厚的一块为载玻片，薄的一块为盖玻片。二者的长、宽相同，通常为45mm×26mm。厚的一块为载玻片，薄的一块为盖玻片。二者的长、宽相同，通常为45mm×26mm。

二、光源照明系统

         光源照明系统用来供给照亮标本用的光线。显微镜所用的光源有自然光和电光源两种。对采用自然光的显微镜，其光源系统只有一个反射镜。反射镜又叫反光镜。它安装在聚光器下面的镜臂上。反射镜有两个反射面：一面为平面，另一面为凹面。可在水平和垂直两个方向上任意转动。它的作用主要是改变室内光线的方向（凹面镜也有一定的聚光作用），使光线射向聚光镜。
        现代显微镜多使用电光源进行照明。其光源系统由光源灯电路、光源灯、透镜、反射镜，聚光镜等组成。整个光源照明系统安装在灯座内。光源灯一般使用钨灯或卤钨灯。灯的功率从十几瓦到数十瓦不等。光源灯所使用的电压通常为12V以下的低电压，并要求电压可调，以改变光线的亮度。在光源灯的电路部分通常都设有光亮调节器。通过调节光亮调节器，可以很方便地改变投照在标本上光的亮度。
        光源灯的电路的结构形式多种多样。但通常都是采用改变变压器初级线圈电压的方法来进行调压的。常用的改变变压器初级线圈电压的方法有：改变变压器初级所串联的电阻分档来改变变压器的初级电压；用单结晶体管或双向二极管控制可控硅的导通角来改变变压器的初级电压等。具体电路这里不再介绍。

三、机械装置

        显微镜的机械装置是为光学系统服务的。只有精密、灵活、准确的机械装置与良好的光学系统密切配合，才能使显微镜发挥出良好性能。
        图4为一种普通双目显微镜和一种双目显微镜的结构。从图中可知，一般显微镜的机械装置由下列部件组成：

图4 显微镜的结构

（一）镜座与镜臂
1、镜座 
        镜座又叫底座，是整个显微镜的基座。用以支撑整个镜体。镜座下面通常装有四个支撑橡胶脚，以使仪器稳定放在工作台上。
        简易显微镜的镜座多呈马蹄形，用铸铁制造。
        电光源显微镜的镜座多为方形，其内部装有电光源系统。即照明灯、聚光镜、反光镜及光源灯电路等均装在其镜座内。底座侧面装有电源开关和光源亮度调节钮，可根据不同的需要选择合适的亮度。底座后面通常装有电源插座及保险（丝）管。也有的将保险管装在底部的。
2、镜臂　
        呈弓形，立于镜座的上端。对直筒显微镜来说，用它来支撑整个光学系统的大部分机械零件。其下有一个倾斜关节，用以倾斜镜筒。对斜筒显微镜来说，镜臂是固定的，主要用它来支撑镜筒、载物台等其他光学元件。
（二）镜筒
         镜筒又叫目镜头，是金属制的圆筒。其上端可插目镜。单目显微镜镜筒的下端连接物镜，双目及三目显微镜的下端为连接头，被手旋螺钉固定在镜臂上。需要时，旋动手旋螺钉，可以方便地将镜筒从镜臂上取下来。
1、单目镜筒  
       单目镜筒又有直筒和斜筒之分。双目和三目镜筒则都是斜筒式的。直筒显微镜因使用不太方便，目前使用量较少。单目斜筒是在镜筒内安装一个反射棱镜，标本通过物镜到达镜筒的光线被棱镜以45度角反射进入目镜。斜筒式可作360度旋转，使用起来更加方便。
2、双目镜筒  
       双目镜筒由左右两个镜筒组成。镜筒的下部装有一套复杂的反射棱镜机构。如图5所示。

图5 双目镜筒光路

       来自物镜的光线经半五角棱镜两次反射后，折转45度进入分光棱镜。分光棱镜由两块直角棱镜胶合而成。胶合面上镀有分光膜。当光到达分光膜时，有一半反射，进入下棱镜，另一半光透过分光膜，进入上棱镜。光线被上下两个棱镜（即直角棱镜及空间棱镜）反射后进入两个目镜中成像。
       这里为了便于说明，将两个目镜画成上下形式。实际使用的光路是将半五角镜以后的所有部件转动90度，将两目镜变成左右形式。
       为了适应不同人的观察，复合棱镜两侧的反射棱镜的间距通常都设计为可调的。目的是为了适应瞳距不同的人使用。调节范围通常在55mm～75mm之间。双目镜筒一般设计成可伸缩调节方式。这是为了适应视力不同的人使用。调节范围通常在500度近视和远视之间。
3、三目镜筒  
       三目镜筒是为摄影显微配置的。它是在双目镜筒的上方又增加一个镜筒。在此镜筒上可加配照相机。这样既可以观察，又可以摄影。它有两种方式：一种是安装有一个可推拉的棱镜。推入时供平时观察用，拉出时光线全部进入摄影镜筒供照相用。还有一种是既可观察又可同时摄影的三目镜筒。它的光线20％～30％供观察用，70％～80％供摄影用。 在摄影时，可用摄影目镜进行调焦，当看到清晰的物像时，再摄影，便可摄出清晰的照片。
（三）物镜转换器
        物镜转换器装于镜筒下端，用来安装和转换物镜。按安装物镜的孔数不同，可分为两孔式、三孔式、四孔式等几种。以三、四孔具多。按定位方式的不同，物镜转换器可分为外定位式和内定位式两种。但无论哪种方式，其基本结构都是由上下两块凸面朝下的圆盘组成。上面一块固定在镜筒的下端，称为固定盘。下面一块可以绕其中心的大头螺钉旋转，称为转动盘。物镜就分别安装在转动盘的几个对称的螺丝口上。外定位式的转换器，其定位弹簧安装在外面；内定位式的转换器，其定位弹簧片安装在固定盘里面。当转动盘旋转至某一位置时，定位弹簧片上的凸棱落入定位槽中，发出咔嗒一声响，便有一个物镜进入光路。继续旋转转动盘，可将各个物镜依次调在显微镜的光轴位置上。
        对物镜转换器的精度有两点要求：同轴和齐焦。所谓同轴，是指每个物镜被定位即调入光路后，物镜和目镜的光轴应在一条直线上。所谓齐焦，是指用低倍物镜调焦后，从低倍转换到高倍物镜，无须使用粗调，即可初见物像（但允许细调）。齐焦又称为“等高转换”。
（四）载物台与移动器　　
        载物台用于承放标本。它与显微镜的光轴垂直。为了便于操作，载物台上可设一个移动器，叫做带移动器的载物台。当标本被夹入移动器后，使用移动器的横向和纵向调节旋钮或手轮，便可以上下左右移动标本，十分方便。这种载物台与移动器是靠移动器上的一只滚花螺丝连接的。安装移动器时，只要把移动器上两个固定销插入台面的螺丝孔内，再拧紧滚花螺丝即行。图6所示为一种移动器的结构。

图6 移动器
1.活动夹 2.刻度标尺 3.活灵 4.螺杆  5.横向调节旋钮 6、8.固定销  7.滚花螺丝  9.纵向调节旋钮 10.齿条

       可升降式载物台的结构比较复杂。这样的载物台通常由上下两层构成。在上层的表面，还安装有一个标本夹，用以夹持样本。在载物台的下方，还安装有一个纵、横向调节手轮。见图4。
       下层固定在镜臂上，受粗调及细调控制。调节粗调及细调，载物台可上下移动。
       两层之间靠燕尾槽（在下面粗调部分有详细解释）连在一起。在纵向手轮调节下，载物台的上层可以前后移动一定距离。在上层的后部，设有横向移动装置，它受横向手轮调节。调节横向手轮，可使载物台上的样本左右移动。样本移动范围通常为75mm×50mm。
（五）粗动调焦机构
       粗动调焦机构简称粗调，是用来快速调焦的装置。它受粗调手轮控制。旋转粗调手轮，可以使物、目镜与载物台相对明显地移动。极限升降距离通常为30mm左右。
       粗调有三种方式：一种是镜筒升降式，一种是镜臂升降式，第三种是载物台升降式。无论哪种方式，粗调的基本结构都是由齿轮来带动齿条运动。齿轮固定在粗动手轮的转轴上，齿条固定在镜筒、镜臂上。齿轮和齿条咬合在一起。转动手轮时，齿轮通过齿条带动镜筒（或镜臂或载物台）作相应的上升或下降。其上下运动的方向，由燕尾导轨作精确控制。燕尾导轨是精密加工的部件，由燕尾条和燕尾槽组成。燕尾条在燕尾槽内滑动或燕尾槽在燕尾条上滑动。它们之间的配合紧密、平稳、没有松动，可保证光学系统作平稳而准确的直线运动。
        对一般载物台升降式的粗调来说，其松紧是可调节的。在右方粗动手轮内侧有一个压直纹的手轮，将它顺时针方向旋转，粗动变紧；逆时针方向旋转，粗动变松。
（六）微动调焦机构
         微动调焦机构简称微调，是对显微镜作精细调焦用的装置。它的总调节距离一般为1.8mm～3mm，由微动手轮控制。旋转微动手轮时，通过多级齿轮变速传动机构，能使载物台作精细的缓慢升降移动，其光学系统也随之非常慢地移动。通常上升或下降2mm的距离，需要转动十几圈。
         微调装置常见的有杠杆式、齿轮式和偏心轮式等多种结构。其具体结构比较复杂，这里不作详述。

  显微镜的光学性能由下列八个基本光学参数（或参量）来决定:

（一）数值孔径 

       数值孔径又叫镜口率。它是指所观察的物体与镜头间介质的折射率n与物镜镜口角α一半的正弦值的乘积。用N.A或A.来表示。即：N.A.＝nsin（α/2）
       所谓镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角。即图1中的角α。

图1 显微镜的镜口角
1、物镜   2、标本 、α、镜口角

       数值孔径是物镜与聚光镜的重要参数，与显微镜的其它各个光学参数都有密切关系。一般希望它越大越好。从公式中可知：提高数值孔径有两种方法，一是增大镜口角，二是增大物镜与标本之间的折射率。
       采取前一种方法时，可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，α总是小于180°。这样，sin（α/2）也小于１。而空气的折射率n＝1。因此，干燥系物镜的数值孔径nsin（α/2）总是小于1，一般在0.04～0.95之间。
       采取后一种方法时，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。如香柏油的折射率n＝1.515，使用香柏油为介质时，可使数值孔径达到1.2以上。这就是为什么在有些情况下要使用油镜的原因。目前油镜所能达到的最大数值孔径为1.4。

（二）分辨率

       分辨率又叫鉴别率或分辨本领。所谓分辨率是指显微镜分辨被检物体细微结构的能力。它与分辨距离成反比。分辨距离是指能被分辨开的两物点间的最小距离。分辨距离越小，显微镜的分辨率越高。如果两物点间的距离小于分辨距离，就会把两点误看成一点，无法看清其结构。显微镜的分辨率是由物镜决定的。目镜只起放大作用，不能增加显微镜的分辨率。
       在普通中心照明的情况下，物镜的分辨距离ｄ由下式决定。
                      　ｄ＝（λ/2）N.A.　
       式中：ｄ表示分辨距离, 单位是微米，λ表示照明光线的波长，单位也是微米。
       在可见光中，亮度最大而且对人眼最敏感的波长为0.55μm，物镜最大的N. A.为1.4。代入上式可得ｄ近似为0.2μm。即，使用普通光学显微镜，在中心照明的情况下，分辨距离的极限为0.2μm。也就是说，小于0.2μm的两物体，普通光学显微镜无法区分。
       使用紫外线，可以减小照明光线的波长，能使分辨距离达到0.1μm。但因紫外线不能为人眼所见。只能拍成照片后再观察。
       电子流的波长只有0.00387nm。利用“电子透镜”或磁透镜来控制电子流，所制成的电子显微镜的分辨距离达零点几nm。可以用它去观察原子的结构。

（三）放大率

        显微镜的放大率等于物镜的放大率和目镜的放大率的乘积。从原理上讲，放大率可以做的非常大。但是，如果标本的细节不能被物镜分辨开来，放大的再大，也毫无意义。理论上可以推导出来，显微镜最合适的放大率（称为有效放大率，用Ｍ有效表示）是在物镜的数值孔径的500～1000倍之间。即500N.A.≤Ｍ有效≤1000N.A.
        在有效放大率范围内，眼睛可以长时间观察而不易疲劳。如果放大率低于500 N.A.，观察起来就很吃力。如果高于1000N.A.，则会使像质变坏，甚至造成不真实的像。因此，超过1000N.A.的放大率称为无效放大率。

（四）工作距离  

       工作距离是指显微镜调焦后，在使用标准盖玻片和标准机械筒长的情况下，物镜的下表面至盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大率越高，工作距离越短。一般10倍以下的低倍物镜，工作距离为5～7mm，而100倍的油镜，其工作距离只有0.19mm左右。

（五）焦点深度

       当显微镜调焦于标本中某一平面后，不仅这一物平面可以看清楚，而且和它相连的上下两个物平面也能同时看清楚。这上下两个物平面之间的距离叫做焦点深度，简称焦深。
       显微镜的焦深是很小的，而且数值孔径越大、总放大率越大，焦深越小。例如，使用N.A.为1.25/100倍的油镜、12.5倍的目镜观察时，焦深只有0.27μm。这就是说，调焦后一次只看清楚0.27μm厚的一个薄层。而普通标本一般都有几个微米厚。要想看完整个标本，需要使用显微镜的微调机构，自上而下分层观察。

（六）视场

       视场又叫视野。是指显微镜一次能够看到的被检物体的范围。通常我们希望视场尽可能大些。显微镜的视场由物镜的视场和目镜的视场共同决定的。普通物镜的视场小于20mm，大的可达40mm以上。普通10倍目镜的视场为14mm，大的可达24mm以上。物镜与目镜一旦设计好后，其视场便固定了。因一般显微镜的视场较小，不可能在一个视场内看到整个标本，只能看到标本上极小的一个小圆块。而且视场的大小与显微镜的总放大率成反比。总放大率越大，视场越小。解决的办法是利用移动器，使标本的各部分依次进入视场，轮流观察。

（七）镜像亮度

       镜像亮度是指显微镜中所看到的物像的亮暗程度。为了便于观察，我们希望所成的像亮一些。在外部光线不变的情况下，镜像亮度与数值孔径的平方成正比，而与总放大率的平方成反比。要想使镜像亮度大些，应使用大数值孔径的物镜，配以低放大率的目镜。例如，在物镜相同的情况下，使用5倍的目镜与使用10倍的目镜相比，其镜像亮度要大4倍。
使用电光源的显微镜，其镜像亮度可以通过调节照明灯的亮度来控制。

（八）清晰度

       显微镜成像的清晰度取决于其光学系统，尤其是物镜的光学性能。它与显微镜的设计、制造、使用和保管都有关系。是一个很重要而又很复杂的问题。从使用和保管的角度来说，影响清晰度的主要原因有：所使用的盖玻片的厚度不合格、调焦没有调到理想位置、总放大率用得过大、油镜的镜头没有擦干净、镜片生霉等。
      上述八个参数之间是互相联系、互相制约的。例如，使用数值孔径大的物镜，其分辨率、放大率、镜像亮度都大，对观察有利。但它的工作距离短、焦点深度和视场小，使用起来不太方便。在使用中应根据具体使用情况，照顾重点，兼顾其他。使用显微镜的根本目的是要看清楚样本的细节，否则，就失去了使用显微镜的意义。从这个前提条件看来，分辨率应摆在首位，放大率摆在第二位。其余各参数应列入从属地位。因为前两个参数是决定被检物体能否看得见的问题。其余各参数只是决定使用方便不方便或观察效果好不好的问题。因此，使用时，应在保证主要参数满足要求的前提下，适当兼顾其余各参数。